Caryotype humain:Techniques - Indications

Sylvie Girard - Orgeolet

I-Techniques conventionnelles du caryotype constitutionnel postnatal

Le caryotype permet l'observation et la classification des chromosomes présents au cours de la métaphase ou de la prométaphase de la mitose. La résolution de la cytogénétique classique est celle de la microscopie photonique et ne dépasse pas 5.106 pdb.

A-Obtenir des cellules en division

Les lymphocytes sanguins sont le plus souvent utilisés : le sang total, recueilli stérilement sur héparine, est incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (phytohémagglutinine ou PHA).

Les fibroblastes demandent une culture cellulaire de une à trois semaines. Tous les tissus riches en fibroblastes comme la peau, peuvent être utilisés. Le fragment tissulaire est recueilli dans un milieu de culture stérile additionné d'antibiotiques.

B-Obtenir des métaphases nombreuses et de bonne qualité

Après accumulation des cellules en métaphase ou en prométaphase par synchronisation des cultures et/ou blocage de l'appareil fusorial (colchicine), on procède à la dispersion chromosomique dans le cytoplasme par l'action d'une solution hypotonique puis à une fixation.

C- Identifier les chromosomes

1-Les techniques classiques, utilisées en routine

Une simple coloration au Giemsa permet de compter et de classer les chromosomes en fonction de leur taille et de leur indice centromérique.

Les méthodes de marquage révèlent le long des chromosomes une alternance de bandes transversales, faiblement ou fortement colorées, dont la séquence est spécifique de chaque paire chromosomique. Les bandes G (GTG) obtenues par dénaturation enzymatique et les bandes R (RHG) par dénaturation thermique ont chacune un contenu spécifique en ADN mais un mécanisme de formation non élucidé. Ces deux marquages, en contretype, sont complémentaires ; ils révèlent l'euchromatine c'est à dire les régions chromosomiques où l'ADN est transcrit et permettent de visualiser 300 à 500 bandes par lot haploïde de chromosomes.

2-Les techniques spécifiques

Quelques colorations sont spécifiques de segments chromosomiques précis : les bandes C pour l'hétérochromatine constitutive (centromères et constrictions secondaires), l'imprégnation argentique pour les organisateurs nucléolaires (régions contenant les gènes des ARN ribosomiques ou NOR).Les bandes Q (QFQ) par coloration à la quinacrine et observation en fluorescence, sont superposables aux bandes G et colorent intensément la partie distale, hétérochromatique, des bras longs de l'Y , certains centromères et certains bras courts des acrocentriques.

3-Les techniques dynamiques et de haute résolution

L'étude des cellules en prométaphase (fin de prophase ou début de métaphase), par synchronisation des cultures associée à l'incorporation d'analogues de bases (bromodésoxyuridine ou BrdU) qui modifient les propriétés tinctoriales des bandes chromosomiques, permet d'améliorer la résolution du caryotype et d'observer 700 à 1000 bandes par lot haploïde de chromosomes. Des remaniements plus fins de la structure chromosomique peuvent être observés mais l'interprétation est délicate et plus efficace si elle est focalisée sur un chromosome ou une région chromosomique donnés. Pour un nombre croissant de microremaniements, la cytogénétique moléculaire (hybridation in situ surtout) utilisée à bon escient et orientée par le tableau clinique viendra en complément de l'analyse classique.

II-Description du caryotype humain

A- Le chromosome métaphasique

Il est constitué de deux chromatides soeurs réunies par un centromère dont la position définit les bras courts ou p et les bras longs ou q ; l'indice centromérique (p/p+q) distingue les chromosomes méta et submétacentriques des acrocentriques où le centromère est très distal, les bras courts très réduits, surmontés de tiges (organisateurs nucléolaires) porteuses de satellites. Les télomères sont les extrémités distales des chromosomes.

B- La classification des chromosomes

Le caryotype humain comporte 46 chromosomes, soit 22 paires d'autosomes et une paire de gonosomes : deux chromosomes X dans le sexe féminin et un X et un Y dans le sexe masculin. Le caryotype normal s'écrit : 46,XX ou 46,XY.

La morphologie simple, utilisée jusqu'au début des années 1970, classe les chromosomes par leur taille décroissante de 1 à 22 et en groupes de A à G. Cette classification des chromosomes par taille et par l'indice centromérique est très approximative.

Les techniques de marquage identifient chaque paire chromosomique par le motif des bandes claires et sombres. Les bandes sont répertoriées dans une nomenclature internationale. Chaque bras chromosomique est divisé, selon sa taille, en une à quatre régions; chaque région en bandes numérotées du centromère au télomère. Par exemple, la dénomination 6p12 désigne la deuxième bande de la région 1 des bras courts du chromosome 6.

C- Le polymorphisme chromosomique

Le nombre et la morphologie générale des chromosomes sont les mêmes pour tous les individus. Les régions d'hétérochromatine peuvent être le site de variations inter-individuelles, sans conséquences phénotypiques et transmises selon le mode dominant. Ces polymorphismes chromosomiques portent souvent sur la longueur de l'hétérochromatine des bras longs de l'Y, des chromosomes 1, 9 et 16 et sur les bras courts des acrocentriques.

III-Inactivation de l'X

Dans les cellules diploïdes, les gènes s'expriment en double exemplaire mais pour la majorité des gènes portés par l'X, l'expression d'un seul allèle suffit. Chez la femme, un mécanisme de compensation génique propre au chromosome X aboutit à l'inactivation aléatoire de l'un des deux chromosomes X dans chacune de ses cellules. C'est Mary Lyon qui, en 1961, formule l'hypothèse d'un tel mécanisme appelé aussi lyonisation de l'X.

Le processus de cette régulation génique n'est que partiellement compris. L'inactivation est initiée très tôt au cours de l'embryogénèse (14 jours après la fécondation) et entraîne une mosaïque fonctionnelle des gènes de l'X : 50% des cellules expriment l'X maternel et 50% l'X paternel. Elle débute au niveau d'un centre d'inactivation (XIC) situé dans la région Xq13. Elle se propage le long du chromosome de façon discontinue (tous les gènes ne sont pas inactivés) et épargne les deux extrémités appelées régions pseudo-autosomiques, homologues des deux extrémités de l'Y et qui vont s'apparier lors de la méiose masculine. Le XIC contient le gène XIST qui ne s'exprime que sur l'X inactif et dont le transcrit est un ARN, non traduit en protéine. L'inactivation est stable au cours des divisions cellulaires somatiques et la réactivation ne survient que pour les ovocytes.

L'X inactif présente toutes les caractéristiques de l'hétérochromatine : hyperméthylation, réplication tardive en fin de phase S, condensation dans le noyau interphasique. La " chromatine X " ou corpuscule de Barr peut ainsi être visualisée sous forme d'une zone condensée, accolée à la face interne de la membrane nucléaire. Dans les cellules diploïdes, un seul X est actif y compris lorsqu'existent un ou plusieurs chromosomes X surnuméraires. Par conséquent, le nombre de corpuscules de Barr dépend du nombre de chromosomes X de la cellule (n-1) : absent si le caryotype est 46,XY, en un exemplaire s'il est 46,XX ou de formule 47,XXY, double en cas de trisomie X, triple si le caryotype est 48,XXXX.

IV-Indications du caryotype constitutionnel postnatal

Poser l'indication d'un caryotype nécessite un examen clinique précis qui permet souvent de suspecter l'anomalie car la duplication ou la déficience d'un segment chromosomique donné correspond à un syndrome souvent stéréotypé avec une dysmorphie caractéristique. En général les anomalies des autosomes ont des conséquences graves et diffuses et associent : une dysmorphie cranio-faciale, des troubles du tonus, un retard mental, des anomalies des dermatoglyphes et des malformations viscérales fréquentes mais peu spécifiques. Toutefois les indications du caryotype sont relativement restreintes : les maladies géniques ne sont pas, en général, explorées par un caryotype et une malformation viscérale isolée s'accompagne rarement d'une anomalie chromosomique. Les pricipales indications du caryotype sont les suivantes :

A-Chez l'enfant

o Phénotype évocateur d'un syndrome chromosomique courant

o Hypotonie néonatale / dysmorphie/ malformations

o Ambiguïté sexuelle

o Retard mental/ troubles du comportement/ dysmorphie/ malformations

o Troubles du développement sexuel et de la croissance

o Phénotype d'un syndrome avec microdélétion/ duplication

B-Chez l'adulte

o Parents/ famille d'enfants porteurs d'une anomalie de la structure chromosomique

o Couples ayant eu plusieurs fausses couches spontanées

o Antécédents personnels et familiaux de morts foetales ou de malformations récurrentes

o Bilan avant assistance médicale à la procréation

o Aménorrhée/ ménopause précoce

o Azoospermie ou oligospermie sévère